Охрана природы

Гидросфера

 

Методика определения острой

токсичности воды на дафниях

 

 

 

 

 

 

СТ РК 17.1.4.01-95

 

 

 

Издание официальное

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Комитет по стандартизации, метрологии и сертификации Республики Казахстан

Алматы 1996

Предисловие

1. B. РАЗРАБОТАН И ВНЕСЕН       Министерством экологии и биоресурсов Республики Казахстан Государственным научно-производственным объединением промышленной экологии «Казмеханобр» Украинским научным центром охраны вод

2. УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН             в действие Постановлением Коллегии Госстандарта

В ДЕЙСТВИЕ                                      Республики Казахстан от 05.02.96, № 1А

3. ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Настоящий стандарт не может быть тиражирован и распространен без разрешения Комитета по стандартизации, метрологии и сертификации Республики Казахстан

Содержание

1. Область применения.

2. Нормативные ссылки

3. Определения

4. Нормы погрешности определения

5. Метод определения

6. Требования безопасности и требования к квалификации оператора

7. Условия биотестирования

8. Тестовые организмы и реактивы

9. Оборудования и материалы

10. Отбор и подготовка проб для биотестирования

11. Проведение биотестирования

12. Обработка результатов

Приложение А Определение диапазона реагирования

Приложение Б Таблица пробитых величин

Приложение В Пример расчета ЛК 50

Приложение Г Форма изложения результатов биотестирования

Государственный стандарт Республики Казахстан

Дата введения 01.07.95

1 Область применения

Настоящий стандарт устанавливает методику определения острой токсичности на дафниях Daphnia magna straits (Cladocera, Crustacea) сточных и природных вод с минерализацией не более 3 г/л, дехлорированной питьевой воды, а также отдельных веществ и их смеси, растворенных в условиях теста.

Результаты, полученные с помощью данной методики, не могут быть распространены на другие виды гидробионтов.

Настоящий стандарт применяется в лабораториях территориальных комитетов по экологии и природопользованию, других министерств и ведомств, выполняющих работы по биотестированию воды.

Требования настоящего стандарта являются обязательными. Методика разработана на основе ИСО 6341-82 «Качество воды. Определение ингибирования подвижности Daphnia magna straits (Cladocera, Crustacea)».

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие нормативные документы:

ГОСТ 1770-74        Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Технические условия;

ГОСТ4220-75         Калий двухромовокислый. Технические условия;

ГОСТ 6709-72        Вода дистиллированная. Технические условия;

ГОСТ 20227-91      Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования;

ГОСТ 24104-84      Весы лабораторные общего назначения и образцовые. Общие технические условия;

ГОСТ 27065-86      Качество вод. Термины и определения;

РД-118-02-90          Методическое руководство по биотестированию воды ;

ТУ 16-064.011-84   Микрокомпрессор АЭН.

3 Определения

В настоящем стандарте использованы следующие термины и их определения:

Биологическое тестирование воды                         Оценка качества воды по ответным реакциям водных организмов, являющихся тест - объектами (по ГОСТ 27065)

Воспроизводимость результатов                             Характеристика качества, определений,

определений тест параметра                                   отражающая близость к друг другу результатов определений тест - параметра, выполняемых по одной методике, на одном и том же веществе, в различных условиях (различные операторы и/или различные лаборатории и/или различное время проведении эксперимента)

Диапазон реагирования тест-объекта                     Интервал средних летальных концентраций токсического вещества, на которые тест-объект реагирует за заданное время

Издание официальное

Порог чувствительности                                          Минимальная концентрация токсического (их) веществ (в), обнаруживаемая методикой

Разбавление (концентрация)                                   Разбавление сточной или природной воды

среднее летальное (ЛК₅₀)                                         (концентрация токсического вещества), вызывающее гибель 50 % тест-объектов за определенный период времени

Результат биотестирования                                     Конечный вывод (оценка о токсичности воды, установленный(ая)при выполнении следующих процедур: 1) получение пряных результатов наблюдений; 2) определение тест-параметра; 3) оценка тест-параметра по принятому в методике биотестирования критерию

Сходимость результатов определений                   Характеристика качества определений

тест-параметра                                                          отражающая близость друг к другу результатов определений тест-параметра, выполняемых по одной методике, на одном и том же веществе, в одних и тех же условиях биотестирования (в одной лаборатории, одним оператором, в одно и тоже время)

Тест-объект                                                                Организм(ый), используемый(ые) в биотестировании

Тест-параметр                                                           Процент погибших дафний в воде, содержащей токсические вещества, по сравнению с контролем (вода без токсических веществ)

4. Нормы погрешности определения

Порог чувствительности методики- 0,3 мг/л двухромовокислого калия (К₂Сr₂О₂), относительное значение сходимости результатов определений тест-параметра- 15%; относительное значение воспроизводимости результатов определении тест-параметра-25%

5. Метод определения

5.1. Метод определения острой токсичности воды на дафниях основан на установлении различий между выживаемостью дафний, на холящихся в анализируемой воде (опыт) и воде, не содержащей токсических веществ (контроль)

5.2. Критерием острой токсичности является гибель 50 и более процентов дафний в анализируемой воде по сравнению с контролем за время биотестирования (в течении 24,48 или % часов).

6. Требования безопасности и требования к квалификации оператора

6.1. Исполнители должны быть проинструктированы о мерах предосторожности при работе с конкретными вредными веществами и их соединениями

6.2. К проведению опытов и обработке их результатов допускают лиц, имеющих опыт работы в аналитической лаборатории не менее шести месяца, или прошедших стажировку по биотестированию в учреждениях, выполняющих работы аналогичного профиля.

7. Условия биотестированию

Биотестирование проводят при следующих условиях: рассеянном свете с естественной сменой дня и ночи, температуре воды (22 ±3)⁰С и содержании растворенного в ней кислорода не мене 2 мг/ л, в среде, лишенной пыли и паров, токсичных для дафний

8. Тестовые организмы и реактивы

8.1. В качестве тест-объекта используют лабораторную культуру дафний Daphnia magna straus (Cladocera, Crustacea) в возрасте до 1 суток, диапазон реагирования которых за 24 ч биотестирования находится в интервале 0,5 - 2,5 мг/л К₂Сr₂O₇. Содержание культуры дафний в лабораторных условиях и их подготовку к биотестированию проводят в соответствии с РД 118-02.

8.2. Для определения диапазона реагирования тест-объекта используют калий двухромовокислый по ГОСТ 4220 и дистиллированную воду по ГОСТ 6709.

Определение диапазона реагирования тест-объекта производят в соответствии с приложением А настоящего стандарта. Если диапазон реагирования тест-объекта не укладывается в интервал 0,5 - 2,5 мг/л, К₂Сr₂O₇, то дафний в биотестировании не используют, выясняют и устраняют причины ухудшения культуры дафний.

8.3. Для контроля (вода без токсических веществ) и разбавлений используют отстоянную в течение 7 суток водопроводную воду: она должна иметь среднюю жесткость (не более 4,0 мг-экв/л), рН 6,5-8,5, температуру (22 ± 3)⁰С, содержание кислорода - не менее 2 мг/л.

9. Оборудование и материалы

При выполнении экспериментов применяют следующее лабораторное оборудование, посуду и материалы: микрокомпрессор АЭН по ТУ 16-064.011, весы лабораторные общего назначения с наибольшим пределом взвешивания 200 г, 2-го класса точности по ГОСТ 24104, оксиметр 1 (кислородомер ИЛ -115), колбы мерные 2-100-2, 2-200-2, 2-500-2 по ГОСТ 1770, пипетки 4-2-1 или 5-2-1, 4-2-2, или 5-2-2, 6-2-5, или 7-2-5, 6-2-10 или 7-2-10 по ГОСТ 20227, газ планктонный

10. Отбор и подготовка проб для биотестирования

10.1. Пробы сточных и природных вод отбирают в объеме 1 л в соответствии РД 118-02. Биотестирование проб воды проводят не позднее 6ч после их отбора. Допускается хранение отобранных проб при температуре не более 4⁰С в течении 3 суток.

10.2. Перед биотестированием пробы воды фильтруют через фильтровальную бумагу с размером пор 3,5-10 мкм.

10.3. Температуру проб доводят до (2213)⁰С, измеряют концентрацию растворенного в ней кислорода. Если концентрация растворенного кислорода ниже 2,0 мг/л, перед биотестированием воду аэрируют с помощью микрокомпрессора.

10.4. При определении степени токсичности сточной и природной воды, серию их разбавлений водой, используемой для контроля (не менее трех), готовят в геометрической прогрессии с коэффициентом разбавления от 2 до 10, в зависимости от токсичности воды.

10.5 При определении токсичности отдельного(ых) вещества (в) или смеси веществ маточные растворы готовят путем растворения известного количества экспериментального вещества в определенном объеме дистиллированной воды в стеклянном сосуде непосредственно перед использованием.

Серию исследуемых растворов отдельного(ых) вещества (в) или их смеси с различными концентрациями (обычно в геометрической прогрессии), готовят путем добавления маточных растворов исследуемых веществ к воде, используемой для контроля.

11. Проведение биотестирования

При проведении биотестирования выполняют следующие операции:

11.1. В сосуды, предварительно промытые водой, используемой для контроля, наливают 100 мл неразбавленных проб воды или их разбавлений, а также исследуемых растворов отдельных веществ или их смеси (опыт). В другие сосуды наливают такой же объем воды, не содержащей токсических веществ (контроль). Повторность трехкратная.

11.2. В каждый из опытных и контрольных сосудов помещают по 10 экземпляров дафний. Их переносят стеклянной трубкой диаметром 5-7 мм сначала в сачок из планктонного газа, а затем в сосуды, погрузив его в воду.

11.3. Биотестирование проводят в течение 24,48 или 96 ч. Во время биотестирования дафний не кормят.

11.4. В течение эксперимента сосуды должны содержаться при температуре (22 ± 3)°С. Измерение температуры воды в емкостях для биотестирования делают один раз в сутки.

11.5. В процессе эксперимента через 24, 48 и 94 ч проводят учет выживших дафний. Выжившими считают дафний, которые свободно передвигаются в толще воды или всплывают со дна сосуда не позднее 15сек. после его легкого покачивания. Если в любой учитываемый период времен; в анализируемой воде гибнет 50 и более процентов дафний, биотестирование прекращают.

11.6. В конце биотестирования в каждом сосуде измеряют концентрацию растворенного кислорода в воде.

11.7. Результаты биотестирования считают правильными и учитывают, если в конце биотестирования содержание растворенного кислорода в воде не менее 2 мг / л, температура воды в течение биотестирования составляла (22 ±3)⁰С. гибель дафний в контроле не превышала 10 %. Бели любое из условий при биотестировании не соблюдалось, результаты не учитывают, а эксперимент повторяют.

12. Обработка результатов

Обработку результатов биотестирования выполняют следующим способом:

12.1. Из трех повторностей определяют среднее арифметическое количество выживших дафний в контроле и опыте. Затем рассчитывают тест - параметр (А) в соответствии с формулой:

%

где X₁ и X₂ - средние арифметические значения количества выживших дафний в контроле и опыте, экз.

12.2. Вывод о наличии острой токсичности неразбавленной пробы воды делают на основании данных о величине тест-параметра. Пробу воды оценивают как обладающую острой токсичностью, если за время биотестирования гибнет 50 и более процентов дафний по сравнению с контролем.

12.3. При определении острой токсичности разбавленной пробы воды устанавливают среднее летальное разбавление, вызывающее за время биотестирования гибель 50% тест - объектов-ЛК₅₀- 24 (48,96).

При определении острой токсичности отдельного вещества (в) или смеси веществ устанавливают среднюю летальную концентрацию, вызывающую за время биотестирования гибель 50% тест – объектов – ЛК₅₀ - 24 (48,96).

Для установления среднего летального разбавления (концентрации) тест-параметр выражают в условных единицах - пробитах, а разбавление - в логарифмических величинах. Таблица перевода процента гибели дафний в пробиты представлена в приложении Б настоящего стандарта

Для расчета среднего легального разбавления (концентрации) на миллиметровой бумаге в прямоугольной декартовой системе координат на оси абсцисс откладывают логарифмы разбавлений пробы сточной или природной воды (концентраций токсического вещества), а на оси ординат - величину тест - параметра в пробитах.

Далее на основании полученных данных о величине тест-параметра при определенном разбавлении (концентрации) строят зависимость. Затем из точки на оси ординат, равной 50 % гибели тест-объектов, проводят линию, параллельную оси абсцисс, до пересечения с линией графика. Из точки пересечения опускают перпендикуляр на ось абсцисс. Точке пересечения перпендикуляра и оси абсцисс соответствуют логарифм ЛК₅₀ - 24 (48,96).

Затем логарифм ЛК₅₀ переводят в разбавление, выраженное в процентах или безразмерных величинах (в концентрацию, выраженную в мг/л). Пример расчета ЛК₅₀ приведен в приложении В настоящего стандарта.

12.4. Результаты биотестирования оформляют протоколом, форма которого приведена в приложении Г настоящего стандарта.

Приложение А

(Обязательное)

Определение диапазона реагирования тест-объекта

Диапазон реагирования тест-объекта устанавливают для каждой группы дафний непосредственно перед биотестированием в специаль­ных опытах проводимых не менее чем в трех повторностях

Для определения диапазона реагирования тест-объекта в качестве токсического вещества используют двухромовокислый калий (К₂Сr₂О₇) марки х.ч. Из него готовят маточный раствор из расчета 1г К₂Сr₂О₇ на 1 литр дистиллированной воды. Далее методом разбавлений готовят серию растворов, содержащих от 0,1 до 3,0 мг / л двухромовокислого калия. Биотестирование проводят длительностью 24ч в соответствии с разделом 11 настоящего стандарта. На основании полученных результатов рассчитывают среднюю концентрацию К₂Сr₂О₇ вызывающую гибель 50% тест - объектов за 24ч эксперимента (ЛК₅₀)

На основании полученных данных определяют интервал, в котором находятся средние легальные концентрации токсического вещества, при этом исходят из наибольших и наименьших значений ЛК₅₀ – 24. Далее эти величины сравнивают с нормативными, указанными в разделе 4. Если полученные ЛК₅₀ находятся в интервале 0,5 - 2,5 мг/л К₂Сr₂О₇ то культура дафний, из которой были отобраны тест - объекты для установления диапазона реагирования, может быть использована для биотестирования проб воды или распоров токсических веществ.

Приложение Б

(Информационное)

Таблица пробитых величин

% гибеля дафний	Пробиты	% гибеля дафний	Пробиты	% гибеля дафний	Пробиты	% гибеля дафний	Пробиты	% гибеля дафний	Пробиты	% гибеля дафний	Пробиты
1	2,67	18	4,08	35	4,61	52	5,05	69	5,50	86	6,08
2	2,95	19	4,12	36	4,64	53	5,08	70	5,52	87	6,13
3	3,12	20	4,16	37	4,67	54	5,10	71	5,55	88	6,18
4	3,25	21	4,19	38	4,69	55	5,13	72	5,58	89	6,23
5	3,35	22	4,22	39	4,72	56	5,15	73	5,61	90	6,28
6	3,45	23	4,26	40	4,75	57	5,18	74	5,64	91	6,34
7	3,52	24	4,29	41	4,77	58	5,20	75	5,67	92	6,41
8	3,59	25	4,33	42	4,82	59	5,23	76	5,71	93	6,48
9	3,66	26	4,36	43	4,84	60	5,25	77	5,74	94	6,55
10	3,72	27	4,39	44	4,86	61	5,28	78	5,77	95	6,64
11	3,77	28	4,42	45	4,87	62	5,31	79	5,81	96	6,75
12	3,83	29	4,45	46	4,90	63	5,33	80	5,84	97	6,88
13	3,87	30	4,48	47	4,92	64	5,36	81	5,88	98	7,05
14	3,92	31	4,50	48	4,95	65	5,41	82	5,92	99	7,32
15	3,96	32	4,53	49	4,97	66	5,44	83	5,95
16	4,01	33	4,56	50	5,00	67	5,47	84	5,98
17	4,05	34	44,59	51	5,03	68	5,49	85	6,04

 

Приложение В

(Информационное)

Пример расчета ЛК₅₀

Для определения ЛК₅₀-9б двухромовокислого калия (К₂Сr₂О₇) был приготовлен маточный раствор из расчета 1,0г К₂Сr₂О₇ на 1л дистиллированной воды. Далее методом разбавлений приготовлена серия растворов, содержащих от 0,3 до 0,7 мг/л двухромовокислого калия. При биотестировании этих растворов в течении 96ч были получены следующие результаты. В контроле гибель дафний не наблюдалась. В концентрации 0,3 мг/л К₂Сr₂О₇; в первой повторности из 10 дафний выжило 9, во второй и третьей - гибель дафний не зафиксирована. В концентрации 0,4 мг/л выжило соответственно 8,9 и 9, в 0,5 мг/л-7,7 и 6, в 0,6 мг/л-5, 5 и 4, в 0,7 мг/л-3, 3 и 2 дафний. Рассчитываем среднее арифметическое количество выживших дафний в контроле и при различных концентрациях двухромовокислого калия. Далее в соответствии с 12.1 настоящего стандарта рассчитываем тест-параметр - процент гибели дафний, находящихся в растворе К₂Сr₂О₇ по сравнению с контролем. Он составил для 0,3 мг/л К₂Сr₂О₇-3, 0,4 мг/л-14,0,5 мг/л-34, 0,6 мг/л -54, 0,7 мг/л-73 %. На основали этих данных строим график на плоскости в прямоугольный декартовой системе координат (рис1). Для этого концентрации К₂Сr₂О₇ переводим в логарифмы. Получаем следующие величины: 0,3 мл/г- (-0,52), 0,4 мг/л- (-0,40), 0,5 мг/л- (-0,3), 0,6 мг/л- (-0,28), 0,7мг/л- (-0,15). Затем эти значения откладываем на оси абсцисс. На оси ординат откладываем значения тест-параметра в пробитии, полученные точки соединяем прямой, равноудаленной от всех точек. Затем от значения на оси ординат, соответствующего 50% тест-объектов (в пробитах-5,0) проводим прямую, параллельную оси абсцисс. Из точки пересечения этой линии с экспериментальной прямой опускаем перпендикуляр на ось абсцисс. Точка пересечения, равная (-0,24) является логарифмом концентрации двухромовокислого калия, вызывающей гибель 50% тест-объектов за 96ч - ЛК₅₀-96. Переводим логарифм в концентрацию: (-0,24) соответствует концентрации 0,58 мг/л. Таким образом, ЛК₅₀-96 двухромовокислого калия равно 0,58 мг/п.

Приложение Г

(обязательное)

Форма наложения результатов биотестирования

Форма 1

Протокол №

Определения острой токсичности на дафниях

Дата отбора пробы                                                                Диапазон реагирования тест-объекта

Место отбора пробы

Дата проведения биотестирования

Форма 2

Длительность биотестирования, ч	Температура, 0С	Количество выживших дафний, экз.								Тест параметр	Приме-чания
		в контроле				в тестируемой воде
		повторности			среднее арифметическое	повторности			среднее арифметическое
		1	2	3		1	2	3
24
48
96
Всего

Оценка токсичности пробы

____________________________________Воды (вещества)_____________________________

Сточной (природной)                                                        (не) оказывает токсического действия

Оператор _____________                                                  _________________________________

подпись                                                                      Фамилия, имя, отчество