СТ РК 17.1.4.02-96 Охрана природы. Гидросфера. Методика определения острой токсичности воды на водорослях

Государственный стандарт Республики Казахстан

 

Государственный стандарт Республики Казахстан

 

 

 

 

 

 

Охрана природы

Гидросфера

 

 

 

 

 

 

 

Методика определения острой

токсичности воды на водорослях

 

 

 

СТ РК 17.1.4.02-96

 

 

Издание официальное

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Комитет по стандартизации, метрологии и сертификации

Республики Казахстан

Алматы


Предисловие

Разработан и внесен                                                Министерством экологии и биоресурсов Республики Казахстан

                                                                                   Государственным научно-производственным объединением промышленной экологии «Казмеханобр»

Утвержден и введен в действие                            Постановлением Комитета по стандартизации, метрологии и сертификации Республики Казахстан от

Введен впервые

Настоящий стандарт не может быть тиражирован и распространен без разрешения Госстандарта Республики Казахстан.


Содержание

1. Область применения

2. Нормативные ссылки

3. Определения

4. Нормы погрешности определения

5. Метод определения

6. Требования к безопасности и требования к квалификации оператора

7. Отбор, хранение, подготовка проб, приготовление разбавлений проб воды и растворов токсических веществ

8. Тест-объект

9. Оборудование и материалы

10. Условия биотестирования

11. Проведение биотестирования

12. Обработка результатов

Приложение А     Определение диапазона реагирования тест-объекта

Приложение Б      Таблица пробитных величин

Приложение В      Пример расчета ЛК 50
Приложение Г      Формы изложения результатов биотестирования

 


Государственный стандарт Республики Казахстан

Охрана природы. Гидросфера.

Методика определения острой токсичности воды на водорослях.

 

Дата введения ___________

1. Область применения

Настоящий стандарт устанавливает методику определения острой токсичности на водорослях Scenedesmus quadricauda (Turb.) Breb., Chlorella vulgaris Beijer сточных и природных пресных вод, а также отдельных веществ и их смесей, растворенных в условиях теста.

Настоящий стандарт применяется в лабораториях территориальных комитетов по экологии и природопользованию, других министерств и ведомств, выполняющих работы по биотестированию воды.

Требования настоящего стандарта являются обязательными.

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие нормативные документы:

 

ГОСТ 17.1.5.05-85      "Охрана природы. Гидросфера. Общие требования к отбору проб поверхностных и морских вод, льда и атмосферных осадков"

ГОСТ 612-75               "Марганец хлористый. Технические условия"

ГОСТ 1770-74             "Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Технические условия"

ГОСТ 2874-82             "Вода питьевая. Гигиенические требования и контроль за качеством"

ГОСТ 4174-77             "Цинк сернокислый. Технические условия"

ГОСТ 4198-75             "Калий фосфорнокислый однозамещенный. Технические условия"

ГОСТ 4217-77             "Калий азотнокислый. Технические условия"

ГОСТ 4220-75             "Калий двухромовокислый. Технические условия"

ГОСТ 4222-76             "Калий углекислый. Технические условия"

ГОСТ 4523-77             "Магний сернокислый. Технические условия"

ГОСТ 6709-72             "Вода дистиллированная. Технические условия"

ГОСТ 9336-75             "Аммоний ванадиевокислый. Технические условия"

ГОСТ 9656-75             "Реактивы. Кислота борная.

ГОСТ 12026-76           "Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия"

ГОСТ 20227-91           "Посуда лабораторная, стеклянная. Пипетки градуированные. Технические условия"

ГОСТ 24104-84           "Весы лабораторные общего назначения и образцовые. Общие технические условия"

ГОСТ 27065-86           "Качество вод. Термины и определения"

ГОСТ 28498-90           "Термометры жидкостные стеклянные. Общие технические требования. Методы испытаний"

ISO 8692                      "Water quality - Fresh water algal growth inhibition test with Sce.nedesmus subspicatus and Selenastrum capricornutum".

HBH 33-5.3.01-85        "Инструкция по отбору проб для анализа сточных вод"

РД 118-02-90               "Методическое руководство по биотестированию воды"

ТУ 16-064. 011-84       "Микро компрессор АЭН"

ТУ 6-09-1013-76.        "Кальций азотнокислый. Технические условия"

ТУ 6-09-4471-77.        "Молибден (VI) оксид. Технические условия"

ТУ 27-31-29-39-80      "Автоклавы. Технические условия"

ТУ 64-1-33-81             "Дозаторы пипеточные"

 

3 Определения

В настоящем стандарте использованы следующие термины и определения:

Биологическое                                  Оценка качества воды по ответным тестирование воды. реакциям водных организмов, являющихся

                                                           тест-объектами.

Тест-объект                                       Организм (ы), используемый (ые) в биотестировании.

Результат                                           Конечный вывод (оценка) о токсичности биотести-рования воды, установленный(ая) при выполнении следующих процедур: 1) получение

прямых результатов наблюдений; 2) определение тест-параметра по принятому в методике биотестирования критерию.

Токсичность воды                            Свойство воды вызывать патологические

изменения или гибель организмов, обусловленное присутствием в ней токсических веществ.

Острая летальная                             Свойство воды вызывать гибель тест-токсичность воды объекта за непродолжительное время

биотестирования, как правило, за период от 0 до 96 часов.

Критерий токсичности                    Значение тест-параметра или правило, на основании которого судят о токсичности воды (по РД 118-02).

Тест-параметр                                  Процент ингибирования роста водорослей

в воде, содержащей токсические вещества, по сравнению с контролем (вода без токсических веществ)

Разбавление среднее                        Разбавление сточной или природной воды

эффективное (ЭP50)                          вызывающее 50 процентов ингибирования

роста культуры водорослей за установленный период времени

Концентрация средняя                    Концентрация вещества (смеси веществ), эффективная

K50) которая вызывает                 50 процентов ингибирования роста культуры

                                                           водорослей за установленный период времени

Эталонное вещество                        Токсическое вещество, используемое для

установления сходимости, воспроизводимости результатов биотестирования, диапазона реагирования тест-объекта

Воспроизводимость                         Характеристика качества определений,

результатов определений                отражающая близость друг к другу результатов

тест-параметра                                 определений тест-параметра, выполняемых по одной методике на одном и том же эталонном веществе в различных условиях (различные операторы и/или различные лаборатории, и/или различное время проведения эксперимента)

Сходимость результатов                  Характеристика качества определений,

определений тест-пара метра         отражающая близость друг к другу результатов определения тест-параметра, выполняемых по одной методике, на одном и том же эталонном веществе, в одних и тех же условиях биотестирования (в одной лаборатории, одним оператором, в одно время)

Диапазон реагирования                  Интервал концентраций эталонного вещества(в), на которые тест-объект реагирует за заданное время и относительно которого определяют пригодность тест-объекта для биотестирования

Ингибирование                                Процесс торможения роста культуры водорослей под действием токсического(их) вещества(в)

4 Нормы погрешности определения

Относительное среднее квадратичное отклонение величин ЭК50-96 К2Сr2O7, характеризующее сходимость результатов биотестирования, составляет 13 процентов, характеризующее воспроизводимость результатов - 20 процентов.

5 Метод определения

5.1 Метод определения острой токсичности воды на водорослях основан на определении изменения интенсивности роста культуры водорослей, находящейся в анализируемой воде (опыт) и воде, не содержащей токсических веществ (контроль).

5.2 Критерием острой токсичности является ингибирование роста культуры водорослей на 50 и более процентов в анализируемой воде (опыт) по сравнению с водой, не содержащей токсических веществ (контроль), за время биотестирования (от 24 до 96 ч).

6 Требования безопасности и требования к квалификации оператора

6.1 Исполнители должны быть проинструктированы о мерах предосторожности при работе с конкретными вредными веществами и их соединениями.

6.2 К проведению опытов и обработке их результатов допускаются лица, имеющие опыт работы в аналитической лаборатории не менее шести месяцев, или прошедшие стажировку по биотестированию в учреждениях, выполняющих работы аналогичного профиля.

7 Отбор, хранение, подготовка проб, приготовление разбавлений проб воды и растворов токсических веществ

7.1 Пробы сточных вод отбирают в соответствии с НВН 33-5.3.01-85 и природных - в соответствии с ГОСТ 17.1.5.05. Пробы воды не подлежат консервации химическими веществами.

7.2 Объем пробы для определения острой токсичности воды должен быть не менее 0,5 дм3. Сосуд наполняют водой под пробку и плотно закрывают.

7.3 Допускается хранение проб не более 72 часов после отбора, в темноте, при температуре не выше 6°С в доверху наполненной и герметично закрытой посуде.

7.4 При необходимости транспортировки - пробы воды должны быть охлаждены до температуры находящейся в диапазоне от 2 до 6°С или заморожены при температуре минус 20°С на месте отбора и транспортированы в таком состоянии. В случае замораживания не следует заполнять сосуды полностью, чтобы избежать их разрыва в момент замораживания.

7.5 Перед биотестированием пробы воды фильтруют через фильтровальную бумагу по ГОСТ 12026. В отдельных случаях, если этого требует цель биотестирования - пробы воды не фильтруют.

7.6 Температуру охлажденных проб воды перед биотестированием доводят до температуры находящейся в диапазоне от 18 до 20°С.

7.7 Для определения среднего эффективного разбавления пробы воды и средней эффективной концентрации вещества (смеси веществ) готовят не менее пяти разбавлений пробы воды или растворов с разными концентрациями вещества (в). Их выбирают так, чтобы получить несколько уровней эффекта (от 3 до 5), которые вызывают ингибирование роста культуры водорослей в диапазоне от 10 до 100 процентов.

7.8 Разбавления пробы воды готовят в геометрической прогрессии с коэффициентом разбавления от 2 до 10 путем прибавления определенного объема пробы в питьевую воду по ГОСТ 2874. Питьевую воду (контроль) предварительно дехлорируют путем отстаивания не менее семи суток.

7.9 Исходный раствор вещества (смеси веществ) готовят путем растворения необходимого количества экспериментального вещества, взвешенного на весах по ГОСТ 24104, в определенном объеме дистиллированной воды по ГОСТ 6709 в мерной колбе по ГОСТ 1770 непосредственно перед использованием.

7.10 Для приготовления растворов с разными концентрациями вещества (в) используют пипетки по ГОСТ 20227. Пипеткой отмеряют определенный объем исходного раствора вещества (в) (см.7.7), переносят мерную колбу по ГОСТ 1770 и доводят до метки питьевой водой по ГОСТ 2874.

7.11 Питьевую воду (контроль) предварительно дехлорируют путем отстаивания не менее семи суток.

8 Тест-объект

8.1 В качестве тест-объекта используют лабораторную культуру водорослей (Scenedesmus quadricauda Breb. или Chlorella vulgarls Beijer).

8.2 Для посева используют 5-7 суточную культуру водорослей, находящуюся в стадии экспоненциального роста.

8.3 Культивирование водорослей в лабораторных условиях и их подготовку к биотестированию проводят в соответствии с РД 118-02.

8.4 Диапазон реагирования культуры водорослей для эталонного вещества - калия двухромовокислого (К2Сr2O7) - находится в интервале концентраций от 0,24 до 1,7 мг/дм3 К2Сr2O7. Если средняя эффективная концентрация (ЭК50) по К2Сr2O7 за 24 часа не укладывается в этот интервал, то водоросли в биотестировании не используют, выясняют и устраняют причины ухудшения культуры.

Определение пригодности тест-объекта для биотестирования проводят в соответствии с приложением А настоящего стандарта.

9 Оборудование, материалы и реактивы

При выполнении экспериментов применяется следующее лабораторное оборудование, посуда, материалы и реактивы: микро компрессор АЭН то ТУ 16-064.011;

весы лабораторные общего назначения с наибольшим пределом взвешивания 200 г, 2-го класса точности по ГОСТ 24104; автоклав по ТУ 27-31-29-80; термометр жидкостный лабораторный с диапазоном от 0 до 50°С и ценой деления 1°С по ГОСТ 28498;

холодильник, поддерживающий температуру ниже 6°С;

колбы мерные емкостью 0,25 и 0,5 дм3, 2-го класса точности по ГОСТ 177

пипетки емкостью от 1 до 10 см3 по ГОСТ 20227;

камера счетная Горяева по ТУ 64-1-816-77;

камера-люминостат с регулируемой температурой;

микроскоп биологический "Виолам";

посуда стеклянная для культивирования водорослей емкостью от 3 дм3 и более;

цилиндр мерный емкостью 100 см3, 2-го класса точности по ГОСТ 1770

аппарат Зейца или другой фильтровальный аппарат.

фильтры стеклянные N 4;

посуда для транспортировки и хранения проб емкостью 0,5 дм3;

бумага фильтровальная по ГОСТ 12026;

калий двухромовокислый по ГОСТ 4220;

калий азотнокислый по ГОСТ 4217-77;

калий фосфорнокислый однозамещенный по ГОСТ 4198-75;

кальций азотнокислый по ТУ 6-09-1013-76;

магний сернокислый по ГОСТ 4523-77;

кислота борная по ГОСТ 9656-75;

молибден (VI) оксид по ТУ 6-09-4471-77;

аммоний ванадиево-кислый по ГОСТ 9336-75.

10 Условия биотестирования

10.1 Биотестирование проводят при следующих условиях: в люминостате или месте защищенном от прямых солнечных лучей инкубируют водоросли в закрытых пробками сосудах при температуре от 18 до 20°С и круглосуточном освещении лампами дневного света 2000-3000 лк, периодически встряхивая или аэрируя.

10.2 Биотестирование проводят непосредственно или не позднее, чем через 6 часов после отбора пробы. При отсутствии такой возможности допускается биотестирование проб, которые хранились при условии согласно п.7.2.

10.3 Биотестирование проводят без регулирования водородного показателя. В случае, если необходимо исследовать токсичность воды, вызванную не водородным показателем, а иными причинами, следует отрегулировать водородный показатель первой исходной пробы (перед серийным разбавлением) до рН 7.0, используя либо соляную кислоту концентрации 1 моль/дм3 либо раствор гидроксида натрия.

11 Проведение биотестирования

При проведении биотестирования выполняют следующие операции:

11.1 В сосуды (колбы) объемом 250 см3, предварительно промытые водой, используемой для контроля, наливают мерным цилиндром по ГОСТ 1770 по 100 см3 неразбавленных проб воды или их разбавлений, или исследуемые растворы отдельных веществ или их смесей (опыт). В контрольные сосуды наливают такой же объем воды, которую готовят согласно 7.11 (контроль). Повторность опыта и контроля двукратная.

11.2 Биотестирование проводят при условиях, изложенных в разделе 10 настоящего стандарта.

11.3 В каждую из опытных и контрольных колб добавляют по 0,5 см3 сгущенной культуры водорослей (не менее 10 млн кл/см3), по ОД см3 каждого солевого раствора и раствора микроэлементов из состава питательной среды (состав искусственной питательной среды приведен в приложении Г настоящего стандарта).

11.4 Колбы закрывают ватно-марлевыми пробками, их содержимое тщательно перемешивают и определяют в каждой колбе исходную численность клеток.

11.5 Биотестирование проводят в течение 96 часов.

11.6 Подсчет численности клеток необходимо производить, как минимум, через 24, 96 часов.

11.7 Для подсчета численности клеток используют счетную камеру Горяева (метод подсчета численности клеток при помощи камеры Горяева приведен в приложении Д настоящего стандарта).

12 Обработка результатов

12.1 Вычисление процента ингибирования (обработка результатов проводится в соответствии с ISO 8692).

Вычисляют площадь А под двойной линейной кривой роста (интеграл биомассы) для каждой исследуемой культуры из уравнения:

где

t1 - время первого измерения после начала испытания;

tn - время счета измерения после начала испытания;

N0 - номинальная исходная плотность клеток;

N1 - измеренная плотность клеток в t1 время;

Nn - измеренная плотность клеток в tT время;

n - число измерений, минимальное количество, не менее 3-х.

Вычисляют средние значения А для каждой исследуемой концентрации (разбавления) и контрольной группы. Из них вычисляют процент ингибирования для каждой исследуемой концентрации (разбавления) по формуле:

где

- процент ингибирования (площадь) для исследуемой концентрации 1;

 - средняя площадь для контрольной группы;

 - средняя площадь для исследуемой концентрации i или разбавления;

12.2 Делают вывод о наличии (или отсутствии) острой летальной токсичности неразбавленной пробы воды на основании величины . Пробу воды оценивают как обладающую острой токсичностью, если за время биотестирования в ней происходит ингибирование роста водорослей на 50 и более процентов по сравнению с контролем.

12.3 При определении острой летальной токсичности вещества (пробы воды) или смеси веществ устанавливают среднюю (ее) эффективную (ое) концентрацию (разбавление), которую(ое) обозначают при длительности биотестирования 24 часа как ЭК50-24 (ЭP50-24). при длительности 96 часов - ЭК50-96 (ЭР50-96)

Для этого строят график зависимости величины тест-параметра от определенного разбавления (концентрации). В прямоугольной декартовой системе координат на оси абсцисс откладывают разбавления пробы сточной или природной воды (концентрации токсического вещества), а на оси ординат - процент ингибирования роста культуры водорослей. При необходимости, разбавление (концентрацию) выражают в десятичных логарифмах.

Затем из точки на оси ординат, равной 50 процентному ингибированию роста тест-объекта, проводят линию, параллельную оси абсцисс, до пересечения с линией графика. Из точки пересечения опускают перпендикуляр на ось абсцисс. Точке пересечения перпендикуляра и оси абсцисс соответствует . ЭК50 (ЭP50)-24(96) или .логарифм ЭК50 (ЭP50)-24(96) (рисунок 1).

Логарифм ЭP50 (ЭК50) переводят в разбавление, выраженное в процентах или безразмерных величинах (в концентрацию, выраженную в мг/дм3 вещества). Пример расчета ЭК50 приведен в приложении Б настоящего стандарта.

12.4 Результаты биотестирования считают правильными и учитывают, если водородный показатель в контрольных сосудах не изменяется более, чем на 1,5 в течение испытания.

12.5 Результаты биотестирования оформляют протоколом, форма которого приведена в приложении В настоящего стандарта.


Приложение А (обязательное)

Проверка пригодности тест-объекта для биотестирования

 

Проверку пригодности тест-объекта проводят непосредственно перед биотестированием.

Для определения пригодности культуры водоросли для биотестирования устанавливают ЭК50-24 раствора эталонного вещества.

В качестве эталонного токсического вещества используют калий двухромовокислый (К2Сr2O7) марки х.ч. Ив него готовят маточный раствор из расчета 1г К2Сr2O7 на 1 дм3 дистиллированной воды. Далее методом разбавлений готовят серию растворов, содержащую от 0,5 до 3,0 мг/дм3 калия двухромовокислого. Биотестирование проводят длительностью 24 часа в соответствии с разделом 10 настоящего стандарта. На основании полученных результатов рассчитывают среднюю эффективную концентрацию К2Сr2O7, вызывающую ингибирование роста культуры водорослей на 50 процентов за 24 часа эксперимента (ЭК50-24).

Если полученная величина ЭК50-24 находится в установленном интервале от 0,24 до 1.7 мг/дм3 К2Сr2O7, то культура водорослей которая использовалась для установления диапазона реагирования, может быть использована для биотестирования проб воды так и растворов токсических веществ. В противном случае водоросли в биотестировании не используют, выясняют и устраняют причины ухудшения культуры.

 


Приложение Б (Справочное)

Пример расчета ЭК50-96

Для определения ЭК50-96 калия двухромовокислого (К2Сr2O7) гото­вится исходный раствор из расчета 1.0 г К2Сr2O7 на 1 дм3 дистиллированной воды. Далее методом разбавлений готовится серия растворов, содержащих от 0,5 до 3,0 мг/дм3 калия двухромовокислого. Биотестирование проводится в течение 96 часов в соответствии с разделом 10 настоящего стандарта. В соответствии с полученным результатом рассчитывается процент ингибирования роста водорослей при различных концентрациях калия двухромовокислого по сравнению с контролем. Он составил для 0,5 мг/дм3 эталонного вещества

15; 1,0 мг/дм3 – 34%;

1,5 мг/дм3 – 42%;

2,0 мг/дм3 – 60%;

2,5 мг/дм3 – 71%;

3.0 мг/дм3 - 89 %.

На основании этих данных строится график на плоскости в прямоугольной декартовой системе координат (рисунок 2). Концентрация (логарифм концентрации) калия двухромовокислого откладывается на оси абсцисс, на оси ординат значения тест-параметра  в процентах (пробитах). Полученные точки соединяются прямой, равноудаленной от всех точек. Затем от значения на оси ординат, соответствующего 50 процентам (в пробитах - 5,0) ингибирования роста водорослей , проводится прямая, параллельная оси абсцисс. Из точки пересечения этой прямой с экспериментальной опускается перпендикуляр на ось абсцисс. Точка пересечения, равная 1,7 мг/дм3, является концентрацией калия двухромовокислого, вызывающей 50 процентное ингибирования роста водорослей за 96ч – ЭК50-96. Таким образом, ЭК50-96 двухромовокислого калия равна 1,7 мг/дм3 .

 


Приложение В

(обязательное)

Форма изложения результатов биотестирования

 

Форма 1

ПРОТОКОЛ N__

Определения острой летальной токсичности на водорослях пробы сточной (природной) воды________________________________________________

название объекта

Дата отбора пробы _________________________________________

Время отбора пробы ________________________________________

Место отбора пробы ________________________________________

Характеристика тест-объекта _________________________________

возраст, диапазон реагирования

Срок от отбора пробы до начала биотестирования __________________

Продолжительность биотестирования ____________________________

 

Сосуды

Темпе-ратура, 0С

Время от начала биотести-рования, ч.

Разбав-ление пробы воды

Численность клеток, тыс. клеток в см3

Среднее значение А (инте-грала биомассы)

Ингибирование роста водорослей, %

Повторность

1

2

1

2

3

4

5

б

7

Конт-рольные

 

 

 

 

 

 

 

опытные

 

 

 

 

 

 

 

 

Вывод о токсичности пробы воды ____________________________________________

Проявляет (не проявляет) острую летальную токсичность

Среднее эффективное разбавление (ЭР50) ____________________

Оператор ________                            ____________________________

подпись                                      Фамилия, имя, отчество

 

 

 

Ключевые слова: ОХРАНА, ПРИРОДА, ГИДРОСФЕРА, ТОКСИЧНОСТЬ, ВОДА, БИОТЕСТИРОВАНИЕ, ВОДОРОСЛИ.






(c) 2020 - All-Docs.ru :: Законодательство, нормативные акты, образцы документов