Охрана природы. Гидросфера.

Методы определения острой токсичности воды на инфузориях.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

СТ РК 17.1.4.04-98

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Издание официальное

Алматы

Предисловие

1 Разработан и внесен

Техническим комитетом по стандартизации ТК 13 Охрана природы ГНПО «Казмеханобр».

2 Принят и введен в действие

Постановлением Госстандарта от 3.11.98 г. №62

3 Введен впервые

 

 

 

 

 

 

Настоящий стандарт не может быть тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Комитета по стандартизации, метрологии и сертификации Министерства энергетики, индустрии и торговли Республики Казахстан.

Содержание

 

1. Область применения                                                                                   1

2. Нормативные ссылки                                                                                  1

3. Определения                                                                                                2

4. Общие положения                                                                                       3

5. Требования по технике безопасности и требования к

Квалификации оператора                                                                               3

6. Отбор, хранение, подготовка проб воды и растворов веществ

для проведения биотестирования                                                                  4

7. Тест-объект                                                                                                   4

8. Оборудование, материалы и реактивы                                                     5

9. Условия биотестирования                                                                          5

10. Проведение биотестирования                                                                  5

11. Приложение А. Биологическая характеристика тест-объекта               10

12. Приложение Б. Подготовка тест-объекта к биотестирования               11

13. Приложение В. Проверка пригодности тест-объекта для

биотестирования                                                                                             12

14. Приложение Г. Пример расчета ЛК₅о- 1                                                 13

15. Приложение Д.

Форма изложения результатов биотестирования                                        15

16. Приложение Е.

Пример расчета ЭК₅о- 72                                                                                18

16. Приложение Ж.

Таблицы пробитых величин                                                                          19

Охрана природы. Гидросфера.

Дата введения 1 июля 1999г.

1 Область применения

Настоящий стандарт устанавливает метод биотестирования на инфузориях Paramecium caudatum Ehrenberg для определения токсичности природных поверхностных и сточных вод с минерализацией до 3 г/дм , водных растворов отдельных веществ и их смесей.

Требования настоящего стандарта являются обязательными для всех лабораторий, выполняющих работы по биотестированию вод.

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие нормативные документы:

 

ГОСТ 171-81               Дрожжи хлебопекарные прессованные. Технические условия.

ГОСТ 1770-74             Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы,

                                      пробирки. Технические условия.

ГОСТ 2874-82             Вода питьевая. Гигиенические требования и контроль за качеством. ГОСТ 4165-78                                      Медь сернокислая. Технические условия.

ГОСТ 4201-79             Натрий кислый углекислый. Технические условия.

ГОСТ 4233-77             Натрий хлористый. Технические условия.

ГОСТ 4234-77             Калий хлористый. Технические условия.

ГОСТ 4523-77             Магний сернокислый. Технические условия.

ГОСТ 12026-76           Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия.

ГОСТ 13646-68           Термометры стеклянные ртутные для точных измерений.

ТУ. ГОСТ 24104-88    Весы лабораторные общего назначения и образцовые. Общие

                                      технические условия.

ГОСТ 25336-82           Колбы конические. Технические условия

ГОСТ 27065-86           Качество вод. Термины и определения.

ГОСТ 28498-90           Термометры жидкостные стеклянные. Общие технические требования.

                                      Методы испытаний.

ГОСТ 29227-91           Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования.

ТУ 6-09-5077-83         Кальций хлористый двуводный, гранулированный, прокаленный.

                                      Технические условия.

ТУ 16-064. 011-84       Микро компрессор АЭН.

НВН-94                        Инструкция по отбору поверхностных и сточных вод на химический

                                      анализ.

3. Определения

В настоящем стандарте использованы следующие термины и определения:

 

Токсичность воды                            - Свойство воды вызывать патологические изменения

или гибель организмов, обусловленное присутствием в ней токсических веществ.

Острая летальная                             - Свойство токсических веществ, растворенных в воде, токсичность воды вызывать гибель организмов за непродолжительное время биотестирования.

Подострая токсичность                   - Свойство токсических веществ, растворенных в воде, воды вызывать нарушение жизнедеятельности организмов за непродолжительное время.

Биологическое тестирование

воды                                                  - Оценка качества воды по ответным реакциям водных организмов, являющихся тест-объектами.

Тест-объект                                       - Организм (ы), используемый (ые) в биотестировании.

Тест-реакция                                     - Изменение какого-либо показателя тест-объекта под влиянием токсических веществ, содержащихся в воде.

Критерий токсичности                    - Значение тест -параметра или правило, на основании которого судят о токсичности воды.

Тест-параметр                                  - Количественное выражение критерия токсичности:

процент погибших инфузории или процент ингибирования их размножения в тестируемой воде по сравнению с контролем (вода без токсических веществ).

Результат биотестирования            - Конечный вывод (оценка) о токсичности воды, установленный при выполнении следующих процедур:

                                                           - получение прямых результатов наблюдении;

- определение тест-параметра по принятому в методике биотестирования критерию.

Разбавление среднее                        - Разбавление сточной или природной воды, при

летальное ЛР₅₀                                  котором гибель тест-объектов за время биотестирования снижается до 50 %.

Концентрация средняя                    - Концентрация вещества(в), которая за время

летальная ЛК₅₀                                 биотестирования вызывает гибель 50% тест-объектов.

Разбавление среднее

эффективное (ая) ЭР₅₀                      - Разбавление сточной или природной воды, при котором ингибирования тест-реакции за время           биотестировании снижается до 50 %.

Концентрация средняя

эффективное ЭК₅₀                            - Концентрация вещества(в), которая за время биотестирования вызывает ингибирования тест-реакции на 50 %

Диапазон реагирования                  - Экспериментально установленный интервал действующий на тест-объект концентраций эталонного вещества, относительно которого определяют пригодность тест-обьекта для биотестирования.

Эталонное вещество                        - Токсическое вещество, используемое для установления сходимости, воспроизводимости результатов биотестирования, диапазона реагирования тест-объекта.

4 Общие положение

4.1 Метод определения острой летальной токсичности природных поверхностных и сточных вод растворов отдельных веществ и их смесей по выживаемости инфузорий основан на установлении количества погибших или обездвиженных особей в течение 1 час в тестируемой воде по отношению к исходному их числу.

4.2 Критерием острой летальной токсичности является гибель или обездвижение 50 и более процентов особей в течение 1 часа в тестируемой воде.

4.3 Метод определения подострой токсичности воды на инфузориях основан на определении изменения показателя размножения инфузорий, находящейся в тестируемой воде (опыт) по сравнению с водой, не содержащей токсических веществ (контроль) в течение 72 часов.

4.4 Критерием подострой токсичности является ингибирование размножения инфузорий на 50 и более процентов в тестируемой воде по сравнению с контролем в течение 72 часов.

5 Требования по технике безопасности и требования к квалификации оператора

5.1 Исполнители должны быть проинструктированы о мерах предосторожности при работе с конкретными вредными веществами и их соединениями, используемыми для биотестирования.

5.2 К проведению опытов и обработке их результатов допускают лиц, имеющих опыт работы в аналитической лаборатории не менее шести месяцев, или прошедших стажировку по биотестированию в учреждениях, выполняющих работы аналогичного профиля.

6 Отбор, хранение, подготовка проб воды и растворов веществ для проведения биотестирования

6.1 Пробы сточных или природных вод для биотестирования отбирают в объеме 50 см³ в соответствии с НВН-94 "Инструкция по отбору поверхностных и сточных вод на химический анализ".

6.2 Допускается транспортировка и хранение проб не более 72 часов после отбора. Хранение осуществляется в темноте, при температуре от +2° до +6° С, в доверху наполненной и герметично закрытой посуде.

6.3 Не допускается консервирование проб с помощью химических веществ.

6.4 Перед биотестированием пробы воды фильтруют через широкопористую фильтровальную бумагу.

6.5 В качестве контрольной используют среду Лозина-Лозинского (состав приведен в приложении Б) или питьевую воду, которую дехлорируют путём отстаивания в течение 7 суток.

6.6 Непосредственно перед биотестированием температуру опытной и контрольной воды доводят до (22±4)°С. При необходимости проводят аэрирование воды с помощью микропроцессора, пока концентрация в ней кислорода будет не менее 2 мг/дм³.

6.7 Для определения среднего летального разбавления ЛР₅₀ или среднего эффективного разбавления ЭР₅₀ сточных и природных вод готовят серию разбавлений (не менее четырех) в геометрической прогрессии с коэффициентом 2 контрольной водой.

6.8 Для определения средней летальной концентрации ЛК₅₀ отдельных веществ или их смесей готовят исходный раствор вещества (отдельно для каждого из смеси) путем растворения точной его навески в определенном объеме питьевой воды (ориентировочно от 0,1 до 10 г/дм³). Исходный раствор готовят в мерной колбе, доводя его уровень до метки.

6.9 Для предварительной оценки интервала концентраций вещества, действующих на тест-объект, готовят серию разбавлений исходного раствора в геометрической прогрессии 10 питьевой водой.

6.10 Для биотестирования растворов вещества (смеси веществ) готовят серию разбавлений исходного раствора вещества (смеси исходных растворов веществ) питьевой водой с таким расчетом, чтобы охватить установленный по п. 6.9 интервал концентраций и получить не менее пяти значений тест-параметра (от 10 до 90 %).

7 Тест-Объект

7.1 В качестве тест - объекта используют лабораторную монокультуру инфузорий Paramecium caudatum Ehrenberg

Систематика, способы культивирования и подготовки инфузорий к биотестированию даны в приложениях А и Б.

7.2 Диапазон реагирования культуры при биотестировании по выживаемости инфузорий в течение 1 часа находится в интервале концентраций эталонного вещества сульфата меди (CuSO₄ -5H₂O) от 0,4 до 0,7 мг/дм³.

7.3 Диапазон реагирования культуры при биотестировании по показателю размножения инфузорий определяемому в течение 72 часов, должен находится в интервале концентраций сульфата меди (CuSO₄ -5Н₂О) от 0,008 до 0,015 мг/дм³.

7.4 Проверка пригодности тест-объекта для биотестирования проводиться на растворах эталонного вещества в соответствии с приложением В настоящего стандарта. Если в указанный выше диапазон реагирования тест-объект не укладывается, то культура для биотестирования не используется, выясняют причины ухудшения её чувствительности.

8 Оборудование, материалы и реактивы

Используют следующее лабораторное оборудование, посуду, материалы и реактивы:

микроскоп бинокулярный стереоскопический, МБС-1, 9;

микро компрессоры АЭН по ТУ 16-064.011;

термометр жидкостный лабораторный с диапазоном от 0 до SO и ценой деления 1°С по ГОСТ 13646;

холодильник, поддерживающий температуру ниже +6°С;

блок микроаквариумов или предметные стекла с лунками;

пипетки капиллярные по ГОСТ 29227;

чашки Петри;

бумага фильтровальная по ГОСТ 12026,

весы лабораторные общего назначения с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104;

колбы мерные 2-100-2,2-200-2,2-500-2 по ГОСТ 1770;

стаканы В-1-50ТХС,В1-100ТХС по ГОСТ 25336;

пробирки мерные 11-2-10,11-2-15 по ГОСТ 1770;

пипетки градуированные 4-2-1 или 5-2-1; 4-2-2 или 5-2-2; 6-2-5 или 7-2-5; 6-2-10 или 7-2-10 по ГОСТ 20227;

колбы конические Кн-2-10-18, Кн-2-25-18 по ГОСТ 25336;

пипетки автоматические по ГОСТ 29227;

вода водопроводная по ГОСТ 2874;

дрожжи хлебопекарные по ГОСТ 171;

натрий хлористый по ГОСТ 4233;

натрий кислый углекислый по ГОСТ 4201;

магний сернокислый по ГОСТ 4523;

кальций хлористый двуводный по ТУ6-09-5077

медь сернокислая пятиводная по ГОСТ 4165-78

9 УСЛОВИЯ БИОТЕСТИРОВАНИЯ

Биотестирование проводят в не стерильных условиях, в помещении, не содержащем вредных паров и газов, при рассеянном свете и температуре воздуха от 18° до 26° С. Содержание кислорода в контрольной и тестируемой воде должно быть не менее 2 мг/дм³.

10 Проведение биотестирования

10.1 Проведение биотестирования по выживаемости инфузорий

При проведении биотестирования выполняют следующие операции:

10.1.1 Для биотестирования неразбавленной пробы сточной или природной воды или ее разбавлений, а также растворов отдельных токсических веществ (смеси веществ) используют блок микроаквариумов из прозрачного пластика с объемом лунок 0,4 с*г (рисунок I). При отсутствии блока микроаквариумов можно использовать предметные стекла с лунками или чашки Петри с нанесенной на дно стекло карандашом или парафином сеткой с размером квадратов 2 х 2 см (рисунок 2).

10.1.2 Для биотестирования используют культуру инфузорий, находящуюся в конце логарифмической - начале стационарной фазы роста (в соответствии с приложением Б).

10.1.3 В каждую лунку (квадрат) микропипеткой помещают от 3 до 5 инфузорий в объёме среды не более 0,02 см³ и добавляют по 0,3 см³ контрольной или анализируемой воды. Таким образом заполняют пять контрольных лунок (квадратов) и далее по столько же для каждой концентрации вещества (смеси веществ) или для каждой пробы воды и ее разбавлений.

10.1.4 Отмечают время начала биотестирования и через 1 минуту подсчитывают под микроскопом исходное количество особей в каждой капле.

10.1.5 чтобы предотвратить испарение воды из капель за время опыта сверху блок микроаквариумов с заполненными лунками закрывают пластинкой соответствующего размера; стекла с нанесенными каплями помещают в закрывающие чашки Петри, на дно которых кладут фильтровальную бумагу, смоченную водой; чашки Петри с заполненными каплями закрывают.

ЮЛ.6 Биотестирование проводят в течение I часа.

10.1.7 Биотестирование проводят при условиях, изложенных в разделе 9 настоящего стандарта.

10.1.8 В конце опыта в каждой капле производят подсчет выживших инфузорий для определения наличия (или отсутствия) острого токсического действия тестируемой воды. Выжившими считают инфузории, которые свободно передвигаются в толще воды. Обездвиженных особей относят к погибшим.

Результаты подсчета записывают в рабочий журнал в соответствии с формой, данной в приложении Д (Таблицы Д. 1 и Д.З).

10.1.9 Результаты биотестирования считаются правильными и учитываются, если гибель инфузорий в контрольных лунках (квадратах) не превышает 10 %, в противном случае опыт повторяют.

10.1.10 Вычисление процента погибших особей.

После подсчета общего количества особей, выживших в пяти повторностях по формуле (1) рассчитывают тест-параметр - процент погибших инфузорий в каждом исследуемом растворе определенной концентрации или пробе воды и каждом ее разбавлении*

                                                            (1)

где А- процент погибших инфузорий;

N_H - общее количество инфузорий в начале опыта (в пяти повторностях), шт;

N_K - общее количество инфузорий в конце опыта (в пяти повторностях), шт.

10.1.11 Тестируемую воду оценивают как оказывающую острое летальное токсическое действие, если в течение 1 ч. в ней гибнет 50 и более процентов инфузорий.

10.1.12 При определении степени острой детальной токсичности пробы сточной или природной воды или водного раствора отдельного

 

10.1.13 Для построения графика с целью установления ЛР₅₀ (ЛК)₅₀ тест-параметр выражают в условных единицах - пробитах, а кратность разбавлений (концентрацию) - в логарифмических величинах. Таблица перевода тест-параметра в пробиты представлена в приложении Ж настоящего стандарта.

В прямоугольной системе координат на оси абсцисс откладывают логарифмы концентраций (кратности разбавлений) растворов (проб воды), а на оси ординат - величины тест-параметра в пробитах. Проводят прямую, равноудаленную от всех полученных точек, исключая те из них, которые соответствуют значениям тест-параметра "0" и "100%". Из точки на оси ординат, соответствующей гибели 50 % тест-объектов (S пробитов), проводят линию, параллельную оси абсцисс, до пересечения с графиком. Из этой точки опускают перпендикуляр на ось абсцисс и находят значение логарифма ЛР₅₀ (ЛК₅₀), которое переводят в величину кратности разбавления (концентрацию, выраженную в мг/дм³ вещества (в)). Пример расчета ЛК₅₀ - 1 приведен в приложении Г настоящего стандарта.

10.1.14 Результаты биотестирования представляют в виде протокола в соответствии с приложением Д. (Таблицы Д. I и Д.З)

10.2 Проведение биотестирования по показателю размножения инфузорий.

10.2.1 Процедура подготовки тест-объекта к биотестированию и порядок проведения опыта по показателю размножения инфузорий соответствуют 10.1.

10.2.2 Биотестирование проводят в течение 72 часов.

10.2.3 Биотестирование проводят при условиях, изложенных в разделе 9 настоящего стандарта.

11.2.4 Учёт численности инфузорий в контрольной и исследуемой воде проводят в начале опыта и через 72 часа.

Результаты подсчета записывают в рабочий журнал в соответствии с формой, данной в приложении Д.

10.2.5 Вычисление тест-параметра - процента ингибирования размножения инфузорий.

По формуле (2) рассчитывают относительный показатель размножение инфузорий в контрольной и исследуемой воде:

                                                                                (2)

где X - относительный показатель размножения;

N_н - общее количество инфузорий в начале опыта (в пяти повторностях), тт.;

N_н - общее количество инфузорий в конце опыта (в пяти повторностях), шт.

По формуле (3) вычисляют процент ингибирования размножения инфузорий для каждой исследуемой концентрации вещества (смеси веществ) или для пробы воды и каждого ее разбавления по сравнению с контролем:

                                                           (3)

где I - процент ингибирования размножения;

Х_контр. - относительный показатель размножения в контрольной воде;

Х_контр. - относительный показатель размножения в исследуемой (опытной) воде.

10.2.6 Пробу воды (раствор) оценивают как оказывающую подострое токсическое действие, если за время биотестирования в ней происходит ингибирование размножения инфузорий на 50 и более процентов по сравнению с контролем.

10.2.7, При определении степени острой токсичности пробы сточной или природной воды или раствора вещества (смеси веществ) устанавливают среднее эффективное разбавление (среднюю эффективную концентрацию), вызывающее пятидесяти процентное ингибирование размножения инфузорий в течение 72 часов – ЭР₅₀ – 72*(ЭК₅₀ - 72).

10.2.8 Для построения графика с целью установления ЭР₅₀- 72*(ЭК₅₀- 72) тест-параметра выражают в условных единицах - пробитах, а кратность разбавлений (концентрацию) - в логарифмических величинах. Таблица перевода тест-параметра в пробитах представлена в приложении Ж настоящего стандарта.

В прямоугольной системе координат на оси абсцисс откладывают логарифмы концентраций (кратности разбавлений) растворов (проб воды), а на оси ординат - величины тест-параметра в пробитах (рисунок 3). Проводят прямую, равноудаленную от всех полученных точек, исключая те из них, которые соответствуют значениям тест-параметра "0" и "100 %". Из точки на оси ординат, соответствующей ингибированию инфузорий на 5O % (5 пробитое), проводят линию, параллельную оси абсцисс, до пересечения с графиком. Из этой точки опускают перпендикуляр на ось абсцисс и находят значение логарифма ЭР₅₀(ЭК₅₀) которое переводят в величину кратности разбавления (концентрацию, выраженную в мг/дм³ вещества (в)). Пример расчета ЭК₅₀ - 72 приведен в приложении Е настоящего стандарта.

10.2.9 Результаты биотестирования оформляют протоколом, форма которого приведена в приложении Д настоящего стандарта. (Таблицы Д.2 и Д.4).

Приложение А

(справочное)

 

Биологическая характеристика

Тип Ciliophora, Doffein, 1941

Подтип Ciliata, Petry, 1852

Класс Oligohymenophora,de Peytorac et al., 1974

Отряд Hymenostomatida,DeIagi et Herroward, 1986

Подотряд Peniculina,Faure-Fremeit, 1956

Род Paramecium,Miillev,1786

Вид Paramecium caudatum,Ehrenberg, 1838

Инфузории парамеции - одноклеточные организмы размером 180-300 мкм. Тело сигарообразной или веретеновидной формы, покрытое плотной оболочкой (пелликулой). Передний конец закруглен, задний заострен. Реснички равномерно покрывают все тело.

Питание осуществляется через рот, расположенный на дне околоротовой впадины (перистома).

Ядерный аппарат представлен двумя видами ядер: макронуклеусом и микронуклеусом. Две пульсирующие вакуоли, регулирующие водный баланс, расположены в разных концах тела. Количество пищеварительных вакуолей непостоянно и зависит от количества пищи.

Бесполое размножение осуществляется поперечным делением на две дочерний особи. Половое размножение происходит по типу конъюгации, т. е. временного соединения двух особей для обмена частями ядерного аппарата.

Питаются бактериями, мелкими жгутиконосцами, водорослями.

Приложение Б

(справочное)

 

Подготовка тест-объекта к биотестированию

Состав питательной среды для культивирования и проведения биотестирования на ин­фузориях (среда Лозина Лозинского) (в г/дм³)

NaCl- 0,1;KC1- 0,01;MgSO₄- 0,01;СаС1₂- 0,01;NaHCO₃- 0,02

Питательную среду готовят на отстоянной питьевой воде.

Инфузорий выращивают и поддерживают в культуре в конических колбах объемом 250 см³ или в открытых чашках Петри.

В качестве корма один раз в неделю добавляют сухие пекарные дрожжи из расчета 1 мг на 1 см³ среды.

Выращивание ведут при комнатной температуре от +20° до +25°С, в темноте.

Для биотестирования используют культуру в конце логарифмической фазы начале стационарной фазы роста. Фазы роста популяции инфузорий определяют общепринятыми в микробиологической практике методом, а именно по удельной скорости роста популяции, которая рассчитывается по формуле:

где μ - удельная скорость роста;

N₁ N₂ - концентрация клеток, кл/мл;

t₁ t₂  - время наблюдения, ч

Для контроля за развитием популяции инфузорий отбирают ежесуточные пробы, в которых определяют концентрацию инфузорий подсчетом клеток под микроскопом с использованием счетных камер. При необходимости клетки обездвиживают формалином иди сульфатом меди. Полученное количество клеток пересчитывают на единицу объема (число клеток/см³). Отсутствие прироста клеток в популяции (μ = 0) свидетельствует о конце логарифмической и начале стационарной фазы роста. Обычно при заданных условиях культивирования и температуре около +23°С стационарная фаза наступает на 3 - 4 сутки при плотности культуры 3000 ± 1000 клеток/см³.

Непосредственно перед биотестированием культуру отмывают от продуктов метаболизма и корма - сливают ее в мерные колбы, добавляют свежую среду Лозина Лозинского, заполняя при этом узкую часть колбы (культуру таким образом разводят в 2-4 раза). Концентрат поднявшихся вверх клеток сливают, в колбу доливают следующую порцию свежей среды и операцию повторяют до максимального извлечения инфузорий.

Подготовленная таким образом культура готова к проведению биотестирования.

Приложение В

(обязательное)

 

Проверка пригодности тест-объекта для биотестирования

 

Проверку пригодности тест-объекта проводят непосредственно перед биотестированием

Для определения пригодности культуры инфузорий для биотестирования по выживаемости устанавливают ЛК₅₀ - 1, для биотестирования по темпу размножения – ЭК₅₀ -72 раствора эталонного вещества.

В качестве эталонного токсического вещества используют сульфат меди (CuSO₄ 5H₂O) марки х.ч. Из него готовят исходный раствор из расчёта 1 г (CuSO₄ 5H₂O) на 1дм³ питьевой воды. Далее методом разбавлений готовят серию растворов, содержащую от 0,005 до 0,02 мг/дм³ сульфата меди для биотестирования по выживаемости инфузории и от 0,1 до 1,0 мг/дм³ для биотестирования по показателю размножения инфузорий.

Биотестирование по выживаемости инфузорий проводят длительностью 1 час в соответствии с разделом 10.1 настоящего стандарта. На основании полученных результатов рассчитывают процент гибели инфузорий в каждом растворе определенной концентрации и по графику устанавливают среднюю летальную концентрацию CuSO₄ 5H₂O, вызывающую гибель 50% особей за 1 час эксперимента (ЛК₅₀ -1).

Биотестирование по темпу размножения инфузорий проводят длительностью 72 часа в соответствии с разделом 10.2 настоящего стандарта. На основании полученных результатов рассчитывают процент ингибирования размножения инфузорий и по графику устанавливают среднюю эффективную концентрацию CuSO₄ 5H₂O, вызывающую ингибирование размножения инфузорий на 50 % по сравнению с контролем за 72 часа эксперимента (ЭК₅₀ -72).

Если полученная величина Ж«> - 1 входит в диапазон реагирования тест-объекта от 0,4 до 0,7 мг/дм³ CuSO₄ 5H₂O, а величина ЭК₅₀-72 - в диапазон от 0,008 до 0,015 мг/дм³, то культура инфузорий может быть использована для биотестирования проб воды и растворов токсических веществ. В противном случае инфузории для биотестирования не используют, устанавливают и устраняют причины ухудшения чувствительности культуры.

Приложение Г

(справочное)

Пример расчета ЛК₅₀-1

 

Для определения ЛК₅₀-1 сульфата меди (CuSO₄ 5H₂O) готовят исходный раствор из расчёта 1,0 г CuSO₄ 5H₂O на 1дм³ питьевой воды. Далее методом разбавлений готовится серая растворов, содержащих от 0,1 до 1,0 мг/дм³ сульфата меди.

Биотестирование проводится в течение 1 часа в соответствии с разделом 10.1 настоящего стандарта. По результатам опыта рассчитывают процент погибших инфузорий в растворах с различной концентрацией сульфата меди. В данном примере он составил для 0,1 мг/дм³ эталонного вещества - 10 %; 0,2 мг/дм³ - 22 %; 0,4 мг/дм⁵ - 40 %; 0,6 мг/дм³ 60 %; 0,8 мг/дм³ -83%.

На основании этих данных строится график в прямоугольной системе координат (рисунок Г1). Для этого значения концентрации сульфата меди переводятся в значения десятичных логарифмов:

0,1 мг/дм³ - минус 1

0,2 мг/дм³ - минус 0,70;

0,4 мг/дм³ - минус 0,40;

0,6 мг/дм³ - минус 0,22;

0,8 мг/дм³ - минус 0,097.

Эти значения откладываются на оси абсцисс, на оси ординат значение тест-параметра в пробитах. Проводится прямая, равноудаленная от всех построенных точек, кроме тех из них, которые соответствуют величинам тест-параметра "0" и "100 %". Затем от значения на оси ординат соответствующего 50 процентам (в пробитах - 5.0) гибели инфузорий, проводится прямая, параллельная оси абсцисс. Из точки пересечения этой прямой с графиком опускается перпендикуляр на ось абсцисс. Точке пересечения соответствует значение логарифма "минус 0,32", которое переводится в единицы концентраций. Установленная средняя летальная концентрация сульфата меди равная 0,48 мг/дм³.

 

Приложение Д

(обязательное)

Форма изложения результатов биотестирования

Форма I

ПРОТОКОЛ №__

определение токсичности

_________________________________________________________________________

название вещества, смеси веществ

на инфузориях Paramecium caudatum по тест реакции________________________

Продолжительность биотестирования _____________________________________

Дата начала биотестирования _____________________________________________

Характеристика тест-объекта _____________________________________________

чувствительность по диапазону реагирования

таблица Д1

Средняя летальная концентрация ЛК₅₀_________________________

Оператор _______           _______________________________________

подпись                                                Фамилия, имя, отчество

таблица Д2

вариант	Концентрация вещества, мг/дм3	Время от начала биотестирования, ч.	Численность клеток, шт.					Общее количество шт.	Показатель размножения инфузорий	Ингибирование размножения инфузорий %
			Повторность
			1	2	3	4	5
1	2	3	4					5	6	7
Контрольные		0 72
опытные		0 72

Средняя эффективная концентрация ЭК₅₀ ________________________

Оператор ___________ ____________________________

подпись                                   Фамилия, имя, отчество

ПРОТОКОЛ № __

определения острой токсичности на инфузориях пробы сточной (природной) воды____________________________________________

название водного объекта

на инфузориях Paramecium caudatum по тест-реакции_________________

Дата отбора пробы _______________         ________________

Время отбора пробы_____________________________________

Место отбора пробы_____________________________________________

Характеристика тест-объекта______________________________________________

чувствительность по диапазону реагирования

Срок от отбора пробы до начала биотестирования______________________________

Продолжительность биотестирования__________________________

Таблица Д3

Среднее летальное разбавления JIP₅₀_________________________

Оператор ___________                                      ____________________________

подпись                                                                      Фамилия, имя, отчество

таблица Д4

Среднее эффективное разбавление (ЭР₅₀ )_______________________

Оператор _______                    ________________________________

подпись                                                        Фамилия, имя, отчество

Приложение Е

(справочное)

Пример расчета ЭК₅₀ - 72

Для определения расчета ЭК₅₀ - 72 сульфата меди (CuSO₄ 5H₂O) готовится исходный раствор из расчета 0,1 дм³ питьевой воды. Далее методом разбавлений делают серию растворов, содержащих от 0,005 до 0,020 мг/дм³ сульфата меди.

Биотестирование проводится в течение 72 часов в соответствии с разделом 10.2 настоящего стандарта. На основании полученных данных расчитывают процент ингибирования размножения инфузорий при различных концентрациях сульфата меди по сравнению с контролем. В данном примере он составил

Для 0,005 мг/дм³ - 26,7%,

для 0,007 мг/дм³ - 34,5%,

для 0,010 мг/дм³ - 50,0%,

для 0,015 мг/дм³ - 58,0%,

для 0,020 мг/дм⁵ -80,0%.

На основании этих данных строится график в прямоугольной системе координат (рисунок ЕЛ). Для этого значения концентраций сульфата меди переводятся в значения десятичных логарифмов:

0,005 мг/дм³ - минус 2,30;

0,007 мг/дм³ - минус 2,15;

0,010 мг/дм³ - минус 2,0;

0,015 мг/дм³ -минус 1,82;

0,020 мг/дм³ - минус 1,70.

Эти значения откладываются на оси абсцисс, на оси ординат значения тест-параметра в пробитах. Проводится прямая, равноудаленная от всех построенных точек, кроме тех из них, которые соответствуют величинам тест-параметра "0" и "100 %". Затем от значения на оси ординат соответствующего 50 процентам (в пробитах - 5.0) ингибирования размножения инфузорий, проводится прямая, параллельная оси абсцисс до пересечения с графиком. Из найденной точки опускается перпендикуляр на ось абсцисс. Точка пересечения соответствует значение логарифма "минус 2", который переводится в значение средней эффективной концентрации сульфата меди вызывающей ингибирование размножения инфузорий на 50 % за 72 часа. Установленная таким образом, ЭК₅₀ - 72 равной 0,01 мг/дм³ CuSO₄ 5H₂O.

Приложение Ж

(справочное)

 

Таблицы пробитых величин

 

Процент гибели инфузории	Пробиты	Процент гибели инфузорий	Пробиты	Процент гибели инфузорий	Пробиты	Процент гибели инфузорий	Пробиты	Процент гибели инфузорий	Пробиты
1	2,67	20	4,16	40	4,75	60	5,25	80	5,84
2	2,95	21	4,19	41	4,77	61	5,28	81	5,88
3	3,12	22	4,22	42	4,80	62	5,31	82	5,92
4	3,25	23	4,26	43	4,82	63	5,33	83	5,95
5	3,35	24	4,29	44	4,84	64	5,36	84	5,99
6	3,45	25	4,33	45	4,87	65	5,39	85	6,04
7	3,52	26	4,36	46	4,90	66	5,41	86	6,08
8	3,59	27	4,39	47	4,92	67	5,44	87	6,13
9	3,66	28	4,42	48	4,95	68	5,47	88	6,18
10	3,72	29	4,45	49	4,97	69	5,50	89	6,23
11	3,77	30	4,48	50	5,00	70	5,52	90	6,28
12	3,83	31	4,50	51	5,03	71	5,55	91	6,34
13	3,87	32	4,53	52	5,05	72	5,58	92	6,41
14	3,92	33	4,56	53	5,08	73	5,61	93	6,48
15	3,96	34	4,59	54	5,10	74	5,64	94	6,55
16	4,01	35	4,61	55	5,13	75	5,67	95	6,64
17	4,05	36	4,64	56	5,15	76	5,71	96	6,75
18	4,08	37	4,67	57	5,18	77	5,74	97	6,88
19	4,12	38	4,69	58	5,20	78	5,77	98	7,05
		39	4,72	59	5,23	79	5,81	99	7,32